Untersuchung monoklonaler Antikörper in patientenindividuellen Zubereitungen
Patientenindividuelle Zubereitungen sind Arzneimittel, die aufgrund einer ärztlichen Verschreibung für eine Patientin bzw. einen Patienten zur unmittelbaren Verwendung hergestellt werden. Typische Darreichungsformen derartiger Individualrezepturen, die in jeder öffentlichen Apotheke hergestellt werden können und den meisten Verbraucherinnen und Verbrauchern aus eigener Erfahrung bekannt sein dürften, sind Salben, Cremes, Gele, Kapseln oder Zäpfchen. In speziell ausgestatten Apotheken und Krankenhausapotheken sowie bestimmten Herstellungsbetrieben können jedoch auch parenterale Zubereitungen (Parenteralia) patientenindividuell hergestellt werden.
Der Begriff Parenteralia bezeichnet sterile Zubereitungen, die eine Verabreichung von Arzneistoffen durch Injektion oder Infusion in den menschlichen Körper unter Umgehung des Magen-Darm-Trakts erlauben. Die Anwendung patientenindividuell hergestellter Parenteralia erfolgt in den wenigsten Fällen durch die Patientin bzw. den Patienten selbst, sondern im Krankenhaus oder in einer Arztpraxis.
Die patientenindividuelle Herstellung von Parenteralia spielt u. a. bei der Behandlung von Tumorerkrankungen eine große Rolle. Die Dosierung der Arzneistoffe richtet sich hier meist nach der Körperoberfläche der Patientin bzw. des Patienten und verlangt daher eine individuelle Anpassung der zu verabreichenden Menge des Arzneistoffs (PZ 2004).
Neben den schon lange bekannten – auch als Small Molecules bezeichneten – chemisch-synthetischen Arzneistoffen, kommen in der Therapie von Tumorerkrankungen in den letzten zwei Jahrzehnten vermehrt auch Biopharmazeutika (Biologicals) zum Einsatz. Die größte Rolle spielen hierbei monoklonale Antikörper, die sich durch eine hohe Spezifität und bessere Verträglichkeit, aber auch durch deutlich höhere Arzneimittelkosten im Vergleich zu klassischen Zytostatika auszeichnen.
Um auch die Qualität dieser preisintensiven Arzneimittel im Rahmen der amtlichen Arzneimittelüberwachung kontrollieren zu können, wurde die Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB mit der Etablierung der für die Bestimmung der Identität und des Gehalts dieser Arzneistoffe notwendigen Analytik beauftragt. Die Bedeutsamkeit der Überwachung dieser Arzneimittelgruppe wird durch die im Jahr 2016 bzw. 2021 bekanntgewordenen Vorfälle in einer Bottroper sowie einer Chemnitzer Apotheke verdeutlicht (Apotheke adhoc 2021, Ärzteblatt 2020). Hier wurden zum Teil über Jahre hinweg qualitativ minderwertige parenterale Zubereitungen hergestellt und abgegeben.
Patientenindividuelle Zubereitungen sind Arzneimittel, die aufgrund einer ärztlichen Verschreibung für eine Patientin bzw. einen Patienten zur unmittelbaren Verwendung hergestellt werden. Typische Darreichungsformen derartiger Individualrezepturen, die in jeder öffentlichen Apotheke hergestellt werden können und den meisten Verbraucherinnen und Verbrauchern aus eigener Erfahrung bekannt sein dürften, sind Salben, Cremes, Gele, Kapseln oder Zäpfchen. In speziell ausgestatten Apotheken und Krankenhausapotheken sowie bestimmten Herstellungsbetrieben können jedoch auch parenterale Zubereitungen (Parenteralia) patientenindividuell hergestellt werden.
Der Begriff Parenteralia bezeichnet sterile Zubereitungen, die eine Verabreichung von Arzneistoffen durch Injektion oder Infusion in den menschlichen Körper unter Umgehung des Magen-Darm-Trakts erlauben. Die Anwendung patientenindividuell hergestellter Parenteralia erfolgt in den wenigsten Fällen durch die Patientin bzw. den Patienten selbst, sondern im Krankenhaus oder in einer Arztpraxis.
Die patientenindividuelle Herstellung von Parenteralia spielt u. a. bei der Behandlung von Tumorerkrankungen eine große Rolle. Die Dosierung der Arzneistoffe richtet sich hier meist nach der Körperoberfläche der Patientin bzw. des Patienten und verlangt daher eine individuelle Anpassung der zu verabreichenden Menge des Arzneistoffs (PZ 2004).
Neben den schon lange bekannten – auch als Small Molecules bezeichneten – chemisch-synthetischen Arzneistoffen, kommen in der Therapie von Tumorerkrankungen in den letzten zwei Jahrzehnten vermehrt auch Biopharmazeutika (Biologicals) zum Einsatz. Die größte Rolle spielen hierbei monoklonale Antikörper, die sich durch eine hohe Spezifität und bessere Verträglichkeit, aber auch durch deutlich höhere Arzneimittelkosten im Vergleich zu klassischen Zytostatika auszeichnen.
Um auch die Qualität dieser preisintensiven Arzneimittel im Rahmen der amtlichen Arzneimittelüberwachung kontrollieren zu können, wurde die Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB mit der Etablierung der für die Bestimmung der Identität und des Gehalts dieser Arzneistoffe notwendigen Analytik beauftragt. Die Bedeutsamkeit der Überwachung dieser Arzneimittelgruppe wird durch die im Jahr 2016 bzw. 2021 bekanntgewordenen Vorfälle in einer Bottroper sowie einer Chemnitzer Apotheke verdeutlicht (Apotheke adhoc 2021, Ärzteblatt 2020). Hier wurden zum Teil über Jahre hinweg qualitativ minderwertige parenterale Zubereitungen hergestellt und abgegeben.
Analytik
Die Untersuchung patientenindividueller Zubereitungen mit monoklonalen Antikörpern umfasst zwei wesentliche Schritte: 1. die Bestimmung der Identität des jeweiligen monoklonalen Antikörpers, um zu überprüfen, ob die Zubereitung auch den angegebenen Antikörper enthält sowie 2. die Überprüfung des deklarierten Gehalts in der Zubereitung.
Die Bestimmung der Identität von monoklonalen Antikörpern erfolgt mit zwei getrennten Messungen am LC-QToF-Massenspektrometer.
Für die erste Messung wird eine Lösung der Probe verwendet, die den intakten Antikörper enthält, mit dem Ziel, die Molekülmasse des Antikörpers zu ermitteln. Üblicherweise liegen die zu ermittelnden Molekülmassen der monoklonalen Antikörper in einem Massenbereich von ungefähr 150 kDa. Die Abbildung zeigt ein typisches Messsignal eines Antikörpers, der aus 1.326 Aminosäuren und zwei Glykanen (Mehrfachzucker) besteht. Signifikant sind die vielen einzelnen Signale, die sich über einen großen Massenbereich erstrecken, die die vielen verschiedenen Ladungszustände des Proteins darstellen. Die Berechnung des Molekulargewichts des Proteins erfolgt über die Dekonvolution der einzelnen Ladungszustände. Die interne Vorgabe erlaubt eine Abweichung von max. 5 Da von der theoretischen Masse.
Vor der zweiten Messung wird der monoklonale Antikörper mittels eines Enzyms in kleine Peptidfragmente verdaut. Der Verdau erfolgt mit Trypsin, einer Endopeptidase, die selektiv nach den Aminosäuren Lysin und Arginin spaltet. Die verdaute Lösung mit den verschiedenen Peptidfragmenten wird dann über eine C18-Phase flüssigchromatografisch aufgetrennt und anschließend im MS/MS-Modus vermessen.
Für die Auswertung wird die theoretische Aminosäuresequenz der leichten und schweren Kette des Antikörpers als Referenz in der Auswertesoftware (BioConfirm) hinterlegt. Die nach chromatografischer Trennung in der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) erhaltenen Peptidfragmente werden im Massenspektrometer analysiert (De-novo-Sequenzierung) und mit der theoretischen Aminosäuresequenz verglichen. Bei einer Sequenzabdeckung von > 80 % wird die Identität als gesichert angesehen. In der Abbildung ist das chromatografische Profil der Peptidfragmente dargestellt. Zu jedem Peptidfragment existieren Fragmentierungsdaten, hier am Beispiel des Peptids TPEVTCVVVDVSHEDPEVK.
Die Untersuchung patientenindividueller Zubereitungen mit monoklonalen Antikörpern umfasst zwei wesentliche Schritte: 1. die Bestimmung der Identität des jeweiligen monoklonalen Antikörpers, um zu überprüfen, ob die Zubereitung auch den angegebenen Antikörper enthält sowie 2. die Überprüfung des deklarierten Gehalts in der Zubereitung.
Die Bestimmung der Identität von monoklonalen Antikörpern erfolgt mit zwei getrennten Messungen am LC-QToF-Massenspektrometer.
Für die erste Messung wird eine Lösung der Probe verwendet, die den intakten Antikörper enthält, mit dem Ziel, die Molekülmasse des Antikörpers zu ermitteln. Üblicherweise liegen die zu ermittelnden Molekülmassen der monoklonalen Antikörper in einem Massenbereich von ungefähr 150 kDa. Die Abbildung zeigt ein typisches Messsignal eines Antikörpers, der aus 1.326 Aminosäuren und zwei Glykanen (Mehrfachzucker) besteht. Signifikant sind die vielen einzelnen Signale, die sich über einen großen Massenbereich erstrecken, die die vielen verschiedenen Ladungszustände des Proteins darstellen. Die Berechnung des Molekulargewichts des Proteins erfolgt über die Dekonvolution der einzelnen Ladungszustände. Die interne Vorgabe erlaubt eine Abweichung von max. 5 Da von der theoretischen Masse.
Vor der zweiten Messung wird der monoklonale Antikörper mittels eines Enzyms in kleine Peptidfragmente verdaut. Der Verdau erfolgt mit Trypsin, einer Endopeptidase, die selektiv nach den Aminosäuren Lysin und Arginin spaltet. Die verdaute Lösung mit den verschiedenen Peptidfragmenten wird dann über eine C18-Phase flüssigchromatografisch aufgetrennt und anschließend im MS/MS-Modus vermessen.
Für die Auswertung wird die theoretische Aminosäuresequenz der leichten und schweren Kette des Antikörpers als Referenz in der Auswertesoftware (BioConfirm) hinterlegt. Die nach chromatografischer Trennung in der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) erhaltenen Peptidfragmente werden im Massenspektrometer analysiert (De-novo-Sequenzierung) und mit der theoretischen Aminosäuresequenz verglichen. Bei einer Sequenzabdeckung von > 80 % wird die Identität als gesichert angesehen. In der Abbildung ist das chromatografische Profil der Peptidfragmente dargestellt. Zu jedem Peptidfragment existieren Fragmentierungsdaten, hier am Beispiel des Peptids TPEVTCVVVDVSHEDPEVK.
Die Gehaltsbestimmung des jeweiligen monoklonalen Antikörpers erfolgt über die Messung des Gesamtproteingehalts gemäß Methode 1 der Monographie 2.5.33 des Europäischen Arzneibuchs (Ph. Eur.). Die Methode beruht auf der Eigenschaft von gelösten Proteinen, bei einer Wellenlänge von 280 nm Licht zu absorbieren. Voraussetzung hierfür ist, dass die Proteine aromatische Aminosäuren wie z. B. Tyrosin und Tryptophan enthalten. Zur Quantifizierung werden daher die Absorptionen von proteinhaltigen Lösungen bei einer Wellenlänge von 280 nm mit einem Spektralfotometer gemessen.
Diese Methode ermöglicht eine Beurteilung, ob die richtige Menge des Antikörpers im Arzneimittel enthalten ist.
Mit der Etablierung dieser Methoden in der Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB können die zuständigen Überwachungsbehörden die Qualität patientenindividueller Zubereitungen monoklonaler Antikörper nun auch durch Untersuchung entsprechender Proben überprüfen lassen.
Die Gehaltsbestimmung des jeweiligen monoklonalen Antikörpers erfolgt über die Messung des Gesamtproteingehalts gemäß Methode 1 der Monographie 2.5.33 des Europäischen Arzneibuchs (Ph. Eur.). Die Methode beruht auf der Eigenschaft von gelösten Proteinen, bei einer Wellenlänge von 280 nm Licht zu absorbieren. Voraussetzung hierfür ist, dass die Proteine aromatische Aminosäuren wie z. B. Tyrosin und Tryptophan enthalten. Zur Quantifizierung werden daher die Absorptionen von proteinhaltigen Lösungen bei einer Wellenlänge von 280 nm mit einem Spektralfotometer gemessen.
Diese Methode ermöglicht eine Beurteilung, ob die richtige Menge des Antikörpers im Arzneimittel enthalten ist.
Mit der Etablierung dieser Methoden in der Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB können die zuständigen Überwachungsbehörden die Qualität patientenindividueller Zubereitungen monoklonaler Antikörper nun auch durch Untersuchung entsprechender Proben überprüfen lassen.
Ergebnisse
Die zehn im Jahr 2022 eingesandten Zubereitungen mit monoklonalen Antikörpern entsprachen in ihrer qualitativen und quantitativen Zusammensetzung den Anforderungen. Die Akzeptanzkriterien für den Gehalt liegen bei patientenindividuellen Zubereitungen zwischen 90 und 110 % des deklarierten Gehalts.
Neben der chemisch-analytischen Untersuchung wurden auch die mikrobiologische Qualität dieser Zubereitungen und ihre Kennzeichnung geprüft. Mikrobiologisch entsprachen alle Proben den Anforderungen, bei acht der zehn eingelieferten Zubereitungen wurden jedoch Kennzeichnungsmängel festgestellt.
Als Dienstleiter für die amtlichen Arzneimittelüberwachungsbehörden der Länder Berlin und Brandenburg sowie für den Freistaat Sachsen leistet die Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB mit ihren Untersuchungsergebnissen einen wichtigen Beitrag zur Qualitätssicherung patientenindividuell hergestellter parenteraler Zubereitungen.
Literatur:
PZ – Pharmazeutische Zeitung (2004): Zytostatika individuell dosieren, www.pharmazeutische-zeitung.de/inhalt-25-2004/meran11-25-2004, aufgerufen am 12.06.2023
AVP (2022): Adieu „-mab“! Neue Namen für die monoklonalen Antikörper, Arzneiverordnung in der Praxis, Band 49, Heft 3, September 2022
Apotheke adhoc (2021): Zyto-Skandal von Chemnitz: Was bislang bekannt ist, www.apotheke-adhoc.de/nachrichten/detail/apothekenpraxis/zyto-skandal-von-chemnitz-was-bislang-bekannt-ist, aufgerufen am 12.06.2023
Ärzteblatt (2020): Krebsmedikamente gestreckt: Urteil gegen Apotheker rechtskräftig, www.aerzteblatt.de/nachrichten/114472/Krebsmedikamente-gestreckt-Urteil-gegen-Apotheker-rechtskraeftig, aufgerufen am 12.06.2023
Die zehn im Jahr 2022 eingesandten Zubereitungen mit monoklonalen Antikörpern entsprachen in ihrer qualitativen und quantitativen Zusammensetzung den Anforderungen. Die Akzeptanzkriterien für den Gehalt liegen bei patientenindividuellen Zubereitungen zwischen 90 und 110 % des deklarierten Gehalts.
Neben der chemisch-analytischen Untersuchung wurden auch die mikrobiologische Qualität dieser Zubereitungen und ihre Kennzeichnung geprüft. Mikrobiologisch entsprachen alle Proben den Anforderungen, bei acht der zehn eingelieferten Zubereitungen wurden jedoch Kennzeichnungsmängel festgestellt.
Als Dienstleiter für die amtlichen Arzneimittelüberwachungsbehörden der Länder Berlin und Brandenburg sowie für den Freistaat Sachsen leistet die Arzneimitteluntersuchungsstelle des LLBB mit ihren Untersuchungsergebnissen einen wichtigen Beitrag zur Qualitätssicherung patientenindividuell hergestellter parenteraler Zubereitungen.
Literatur:
PZ – Pharmazeutische Zeitung (2004): Zytostatika individuell dosieren, www.pharmazeutische-zeitung.de/inhalt-25-2004/meran11-25-2004, aufgerufen am 12.06.2023
AVP (2022): Adieu „-mab“! Neue Namen für die monoklonalen Antikörper, Arzneiverordnung in der Praxis, Band 49, Heft 3, September 2022
Apotheke adhoc (2021): Zyto-Skandal von Chemnitz: Was bislang bekannt ist, www.apotheke-adhoc.de/nachrichten/detail/apothekenpraxis/zyto-skandal-von-chemnitz-was-bislang-bekannt-ist, aufgerufen am 12.06.2023
Ärzteblatt (2020): Krebsmedikamente gestreckt: Urteil gegen Apotheker rechtskräftig, www.aerzteblatt.de/nachrichten/114472/Krebsmedikamente-gestreckt-Urteil-gegen-Apotheker-rechtskraeftig, aufgerufen am 12.06.2023